С. Я. ЛОГИНОВА, В. Н. ЩУКИНА, С. В. САВЕНКО, *С. В. БОРИСЕВИЧ

ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России», Сергиев Посад

Antiviral Activity of Kagocel® in vitro Against Virus SARS-CoV-2

S. YA. LOGINOVA, V. N. SHCHUKINA, S. V. SAVENKO, *S. V. BORISEVICH

48 TSNII Ministry of Defence of the Russian Federation, Sergiyev Posad

Изучена противовирусная активность лекарственного препарата Кагоцел®, имеющего высокий профиль безопасности и доказанную эффективность для профилактики и лечения гриппа и ОРВИ в качестве индуктора интерферонов, в отношении нового пандемического штамма SARS-CoV-2 в экспериментах in vitro в культуре клеток Vero C1008. Результаты исследования выявили, что при внесении субстанции Кагоцел® в культуру клеток за 1 ч до инфицирования и через 1 ч после в концентрации 5000 мкг/мл отмечалось подавление цитопатической активности вируса на 100%. Также было установлено, что Кагоцел эффективно подавляет репродукцию вируса SARS-CoV-2, вариант В, в культуре клеток Vero C1008 в дозе 5000 мкг/мл на 1,75 lg, при этом коэффициент ингибирования по подавлению репродукции вируса составил 97,83%.

Ключевые слова: Кагоцел®; COVID-19; SARS-CoV-2; Vero; in vitro; противовирусная активность.

The antiviral activity of the drug Kagocel®, which has a high safety profile and proven efficacy for the prevention and treatment of influenza and AVRI as an interferon inducer, was studied against a new pandemic strain of SARS-CoV-2 in vitro in Vero C1008 cell culture. The results of the study revealed that at the addition of the substance Kagocel® at the concentration of 5000 µg/ml into the cell culture 1 h before the virus infection and 1 h after, there was 100% inhibition of the cytopathic activity of the virus. It was also found that Kagocel at the dose of 5000 µg/ml effectively suppressed the reproduction of the SARS-CoV-2 virus, variant B, in Vero C1008 cell culture by 1.75 lg, the inhibition coefficient was 97.83 %.

Keywords: Kagocel®; COVID-19; SARS-CoV-2; Vero; in vitro; antiviral activity.

ВВЕДЕНИЕ

Вирусное заболевание COVID-19, которому ВОЗ присвоил категорию пандемии, уже вошла в историю как чрезвычайная ситуация мирового масштаба и привлекла к себе внимание специалистов здравоохранения и населения во всём мире [1-2].

Значительный рост числа новых случаев инфицирования этим вирусом демонстрирует актуальность поиска лекарственных препаратов, эффективных в отношении данного возбудителя. Поиск новых лекарственных средств для проведения терапии нового заболевания является долгим и дорогостоящим процессом с высокой частотой выбывания потенциальных препаратов [3-4]. Скорость разработки новых лекарственных средств в условиях глобальной пандемии неприемлема. В связи с этим, в сегодняшней ситуации, когда по объективным причинам, современное медицинское сообщество не может предложить эффективный алгоритм профилактики и лечения коронавирусной инфекции, который бы обладал достаточной доказательной базой, необходимо использовать комбинации лекарственных противовирусных препаратов, уже многократно доказавших свою безопасность и эффективность на штаммах ОРВИ, в т. ч. штаммах коронавирусов. Особое внимание следует уделить индукторам интерферонов [5-6].

Лекарственный препарат Кагоцел® (таблетки 12 мг, Регистрационное удостоверение: РN002027/01 от 09.01.2003 г.) относится к противовирусным препаратам с ИФН-индуцирующей активностью. В результате проведённых экспериментов in vitro и in vivo [7-9] была доказана интерферониндуцирующая, иммуномодулирующая и противовирусная активности препарата Кагоцел® в профилактике и лечении гриппа и ОРВИ [5], в семейство которых входят и коронавирусы. Результаты проведённых регистрационных и пострегистрационных клинических и наблюдательных исследований показали, что применение препарата Кагоцел® как средства лечения и профилактики ОРВИ и гриппа приводило к выработке интерферонов, что позволяло эффективно проводить терапию ОРВИ вне зависимости от того, каким видом вирусов было вызвано заболевание [10–17], что указывает на возможность применения препарата Кагоцел® для лечения и профилактики разнообразных острых респираторных вирусных инфекций, к которым относятся и коронавирусы.

Цель работы — экспериментальное изучение токсичности и противовирусной активности фармацевтической субстанции Кагоцел® in vitro в отношении коронавируса SARS-CoV-2 (COVID-19).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Культура клеток и среды. Эксперименты проводили на постоянной культуре клеток почки африканской зелёной мартышки — Vero C1008. В качестве ростовой и поддерживающей применяли среду Игла (МЕМ) на солевом растворе Хенкса, содержащую, соответственно, 7,5% и 2% фетальной телячьей сыворотки.

Вирус. В работе использовали вирус SARS-CoV-2, вариант В, полученный в 2020 г. из ФГБУ ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора и хранившийся в Специализированной коллекции ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России. Биологическая активность полученного вирусного препарата составляла 7,4 lg БОЕ/мл и 6,5 lg ЦПД50/мл, посторонняя микрофлора отсутствовала.

Исследуемый препарат. Препарат Кагоцел®, субстанция-порошок аморфный, серия 1670918 от 27.09.2018, годен до 09.2022, был предоставлен ГК «НИАРМЕДИК». Стартовый раствор препарата для оценки токсичности для культуры клеток Vero C1008 (10 мг/мл) готовили следующим образом: 10 мг субстанции Кагоцел® растворяли в 9 мл поддерживающей среды в течение 2 ч, рН доводили до 7 раствором 1 М HCl, а затем поддерживающей средой до объёма 10 мл. Фильтровали через насадки шприцевые Minisart® High Flow, диаметр пор 0,22 мкм, «Sartorius Stedim Biotech», кат. № 16541-К. Далее готовили разведения двукратным шагом на поддерживающей среде.

Оценка биологических свойств возбудителя SARS-CoV-2. Биологическую активность оценивали титрованием вируссодержащей суспензии в культуре клеток Vero C1008 по цитопатическому действию вируса.

Оцениваемые параметры. Оценка противовирусной эффективности экспериментальных субстанций осуществлена в соответствии с рекомендациями ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России [18].

Коэффициент ингибирования (КИ, %) рассчитывался по формуле:
КИ = ((Аконтр – Аоп) / Аконтр)100%, где:
Аконтр — биологическая активность вируса, определённая в клетках без внесения химиопрепарата, ЦПД;
Аоп — биологическая активность вируса, определённая в клетках c внесением химиопрепарата, ЦПД.

Основным критерием оценки эффективности препаратов in vitro является коэффициент ингибирования цитопатогенного действия вируса (КИ, %).

Схема внесения исследуемых препаратов. Рибавирин® и Интерферон альфа-2b вносили через 1 ч после инфицирования клеток. Субстанцию Кагоцел® в различных концентрациях добавляли к монослою Vero C1008 два раза: за 1 ч до инфицирования клеток и через 1 ч после. Для этого ростовую среду удаляли с монослоя, вносили исследуемые образцы в концентрации 5 мг/мл и далее, разведённые 2-кратным шагом, через 1 ч инокулят удаляли, трижды промывали поддерживающей средой. После этого вносили вирус SARS-CoV-2, инкубировали в течение 60 мин при температуре 37±0,5°С, затем инокулят удаляли, промывали, вносили свежую среду, содержащую исследуемые образцы в концентрации 5 мг/мл и далее, разведённые 2-кратным шагом. Инкубировали при температуре 37±0,5°С в течение 48 ч.

Культуру клеток инфицировали в дозах 10 ЦПД50 или 100 ЦПД50. Влияние на цитопатогенность вируса оценивали через 24 и 48 ч после инфицирования. Для каждой исследуемой концентрации препарата Кагоцел® использовали по 4 пробирки с монослоем клеток, в трёх независимых опытах (всего пробирок — 12).

Анализ данных. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Microsoft Office Exсel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты изучения токсичности субстанции препарата Кагоцел® для культуры клеток почки африканской зелёной мартышки Vero C1008 выявили, что данное соединение в концентрации 10000 мкг/мл не вызывает деструкцию монослоя и разрушение клеток. Максимальная переносимая концентрация (МПК) для субстанции препарата Кагоцел® составила более 10000 мкг/мл (табл. 1). Следовательно, максимальная стартовая концентрация (1/2 МПК) препарата Кагоцел® для оценки противовирусной активности составила 5 мг/мл. Кагоцел® является крайне малотоксичным соединением.

Таблица 1

Результаты оценки токсичности субстанции препарата Кагоцел® для культуры клеток Vero C1008

Препарат Токсическая концентрация препарата, ЦПД50, мг/мл МПК, мг/мл Х±σx 1/2МПК, мг/мл Х±σx
Кагоцел® > 10,0 > 10,0±0,0 > 5,0±0,0
Контроль среды отсутствует — —

Изучение противовирусной активности субстанции Кагоцел® проводили в культуре клеток Vero C1008, инфицированных вирусом SARS-CoV-2, вариант В, по показателю коэффициента ингибирования цитопатической активности вируса и репродукции вируса.

Через 24 ч инкубирования после инфицирования клеток (в дозе 10 ЦПД50) при внесении препарата Кагоцел® в диапазоне концентраций 156 мкг/мл — 5000 мкг/мл цитопатический эффект вируса не был выявлен. В контрольной группе клеток деструкцию монослоя наблюдали в 50% случаях, поэтому КИ составило более 50%. Даже при 10-кратном увеличении дозы инфицирования (доза 100 ЦПД50) препарат Кагоцел® в диапазоне концентраций 625–5000 мкг/мл полностью подавлял цитопатическую активность вируса SARS-CoV-2, вариант В (КИ в данном случае составил 75%). Ингибирование цитопатической активности вируса в концентрациях 156–313 мкг/мл при этом составило 67% (табл. 2). В этих же условиях референс-препараты в используемых концентрациях полностью подавляли цитопатическую активность вируса как при инфицировании в дозе 10 ЦПД50, так и в дозе 100 ЦПД50 (см. табл. 2).

Через 48 ч инкубирования после инфицирования клеток в дозе 10 ЦПД50 при внесении препарата Кагоцел® в концентрации 5000 мкг/мл цитопатический эффект вируса не был выявлен (КИ равен 100%), в концентрации 2500 мкг/мл — подавление цитопатической активности вируса составило 75%, а диапазоне концентраций 156–1250 мкг/мл препарат не оказывал защитного действия на клеточную культуру. При высокой дозе инфицирования, равной 100 ЦПД50, препарат Кагоцел® не влиял на цитопатическую активность вируса SARS-CoV-2, вариант В, во всем диапазоне изученных концентраций (см. табл. 2). При этом интерферон альфа-2b подавлял цитопатическое действие вируса на 100% как при 10 ЦПД50, так и при 100 ЦПД50, в отличие от альфа-2b Рибавирина. Данный препарат полностью защищал монослой только при дозе инфицирования 10 ЦПД50, а при 100 ЦПД50 его протективные свойства начинали снижаться, и КИ составил только 91,7%.

Снижение противовирусной активности Кагоцела на сроке 48 ч инкубации, по сравнению со сроком 24 ч, может говорить об особенностях механизма его действия и метаболизма в клетке. Не все препараты имеют такую кинетику противовирусного действия в отношении инфекции SARS-CoV-2. Например, хлорохин фосфат и гидроксихлорохин более активны при их инкубировании с клетками Vero в течение 48 ч, по сравнению с 24 часами инкубации [19]. Теоретически, разный способ действия различных препаратов может оказывать синергидное действие при их комбинированном применении и повышать таким образом эффект лечения.

Таблица 2

Результаты оценки противовирусной активности препарата Кагоцел® в отношении вируса SARS-CoV-2, вариант В, в культуре клеток Vero C1008

Препарат 24 ч после инфицирования 48 ч после инфицирования
Название Концентрация, мкг/мл 10 ЦПД50 100 ЦПД50 10 ЦПД50 100 ЦПД50
Частота ЦПД КИ, % Частота ЦПД КИ, % Частота ЦПД КИ, % Частота ЦПД КИ, %
Кагоцел 5000 0/12 >50 0/12 > 75 0/12 100 12/12 0
  2500 0/12 >50 0/12 > 75 3/12 75 12/12 0
  1250 0/12 >50 0/12 > 75 12/12 0 12/12 0
  625 0/12 >50 0/12 > 75 12/12 0 12/12 0
  312 0/12 >50 3/12 67 12/12 0 12/12 0
  156 0/12 >50 3/12 67 12/12 0 12/12 0
Рибавирин® 100 0/12 >50 0/12 > 75 0/12 100 1/12 91,7
Интерферон альфа-2b 104* 0/12 >50 0/12 > 75 0/12 100 0/12 100
Вирусный контроль — 6/12 — 9/12 — 12/12 — 12/12 —
Контроль среды — 0/12 — 0/12 — 0/12 — 0/12 —

Примечание. Здесь и в табл. 3: * — концентрация интерферона альфа-2b в МЕ/мл.

Также было проведено изучение влияния исследуемой субстанции Кагоцел® на репродукцию вируса SARS-CoV-2, вариант В, в культуре клеток Vero C1008 при дозе инфицирования 10 ЦПД50. Учёт результатов через 48 ч после инфицирования. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты оценки противовирусной активности препарата Кагоцел® в отношении вируса SARS-CoV-2, вариант В, в культуре клеток Vero C1008, по подавлению репродукции вируса

Препарат Накопление вируса,lg БОЕ/мл, Х± σx Подавление репродукции вируса, Δ, lg Коэффициент ингибирования (КИ), %
Название Концентрация, мкг/мл
Кагоцел® 5000 5,45±0,07 1,75 97,83
  2500 6,40±0,15 0,80 80,00
  1250 6,99±0,05 0,21 37,37
  625 7,20±0,04 0 0
  313 7,20±0,04 0 0
  156 7,20±0,04 0 0
Рибавирин® 100 5,03±0,15 2,17 99,31
Интерферон альфа-2b 104* 0 7,20 100
Контроль инфицирующей дозы — 7,20±0,04 — —
Контроль среды — — — —

Следовательно, Кагоцел® эффективно подавляет цитопатическую активность вируса SARS-CoV-2, вариант В, в культуре клеток Vero C1008 в диапазоне концентраций 2500–5000 мкг/мл.

Дополнительно, по результатам, учтённым через 48 ч после инфицирования, была проведена оценка 50% ингибирующей концентрации препарата Кагоцел® в отношении вируса SARS-CoV-2, вариант В, в культуре клеток Vero C1008 (табл. 4).

Таблица 4

Результаты оценки эффективной дозы препарата Кагоцел® в отношении вируса SARS-CoV-2, вариант В, в культуре клеток Vero C1008

Препарат 50% ингибирующая концентрация (ЕД50), мкг/мл (по Першину)
по подавлению ЦПД при инфицировании в дозе по подавлению репродукции при инфицировании в дозе
10 ЦПД50 100 ЦПД50 10 ЦПД50
Кагоцел® 2344 Защита отсутствует 2231

Из табл. 4 следует, что при дозе инфицирования 10 ЦПД50 оба метода определения противовирусной активности (по ЦПД и по подавлению репродукции вируса) позволяют определить 50% ингибирующую концентрацию Кагоцела, причём получаемые значения практически идентичны и колеблются около среднего значения 2288,5 мкг/мл. Хотя в рамках данной работы не выявлена токсическая концентрация Кагоцела, в связи с чем максимально переносимая концентрация для культуры Vero C1008 не была установлена, очевидно, что химиотерапевтический индекс для Кагоцела будет достаточно высоким.

Таким образом, препарат Кагоцел® эффективно подавляет размножение нового коронавируса in vitro и является одним из перспективных лекарственных препаратов в отношении COVID-19.

Источник: https://kagocel.ru/